細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作者鼻腔口腔、實(shí)驗(yàn)器材等很多地方都有支原體的存在。因此，細(xì)胞發(fā)生支原體污染的頻率很高。據(jù)美國(guó)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，細(xì)胞發(fā)生支原體污染的幾率在70%以上。

同時(shí)，由于支原體直徑很小，僅在180nm~350nm之間，只有通過(guò)電鏡才能看到。因此，支原體污染不易被實(shí)驗(yàn)者肉眼發(fā)覺(jué)。而支原體污染是個(gè)循序的過(guò)程，普通抗生素對(duì)其無(wú)效。因此，被支原體污染的細(xì)胞會(huì)持續(xù)受到影響，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。

支原體污染不僅是細(xì)胞培養(yǎng)中需要克服的現(xiàn)象，而且是制藥、生物制品生產(chǎn)中需要加以避免的。支原體污染的影響是什么？

 

●抑制細(xì)胞增殖達(dá)50%

●影響免疫反應(yīng)

●影響病毒增殖和感染率

●引起染色體畸變和易位

●干擾雜交瘤技術(shù)使被污染細(xì)胞在HAT培養(yǎng)基更敏感

●在細(xì)胞壁上附著支原體會(huì)改變細(xì)胞壁完整性。

●降低電穿孔轉(zhuǎn)染率達(dá)5%

總之，支原體污染影響細(xì)胞所有的代謝功能。

細(xì)胞被支原體污染，解決方案

方法一：確認(rèn)細(xì)胞已被支原體污染，終止試驗(yàn)，丟棄所有被污染的細(xì)胞和耗材。

重新復(fù)蘇細(xì)胞，注意選用未被污染的細(xì)胞株、血清和培養(yǎng)基，并規(guī)范操作。

方法二：對(duì)于珍貴的，樣品不可再得的細(xì)胞，或價(jià)格昂貴的種子細(xì)胞，不但無(wú)法丟棄，而且作為種子細(xì)胞，還需要**支原體污染。

此時(shí)，需選用特異性的支原體殺除劑，清除污染，保護(hù)細(xì)胞。

目前世界上有效的方法是是德國(guó)的一款生物試劑，由Minerva公司生產(chǎn)，品名Mynox®。

此試劑可在2-3小時(shí)內(nèi)將支原體主動(dòng)殺除，但對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用。特別適合細(xì)胞保種。

Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑，加入培養(yǎng)液中，可特異性地與支原體膜結(jié)合，改變膜通透性。通過(guò)此生物物理的方法，2～3小時(shí)內(nèi)，即可把細(xì)胞中的支原體殺除掉。因?yàn)榧?xì)胞膜結(jié)構(gòu)與支原體膜不同，故Mynox®不會(huì)與細(xì)胞膜結(jié)合，因此無(wú)細(xì)胞毒性。

注意：3小時(shí)后，需將此試劑洗脫，將細(xì)胞更換到新的培養(yǎng)耗材和培養(yǎng)液中，重新培養(yǎng)。

此時(shí)，不應(yīng)使用PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中支原體。由于支原體解體，故PCR結(jié)果為假性強(qiáng)陽(yáng)性。

具體操作流程見(jiàn)下圖：

 

Mynox®祛除貼壁細(xì)胞中支原體的流程圖

Mynox®殺除支原體功能強(qiáng)大有效，但由于價(jià)格昂貴，上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右，使得應(yīng)用于細(xì)胞保種的數(shù)量受到價(jià)格的限制。

方法三：對(duì)于已耗費(fèi)很多時(shí)間，大量擴(kuò)增起來(lái)的細(xì)胞，或經(jīng)過(guò)基因轉(zhuǎn)染、體外刺激等大量工作處理過(guò)的細(xì)胞，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞被支原體污染了，怎么辦？此時(shí)由于前期工作量巨大，使操作人員無(wú)法丟棄已有細(xì)胞。

但由于價(jià)格原因，又無(wú)法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細(xì)胞上的支原體，

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)人員還需要清除細(xì)胞上的支原體污染，讓實(shí)驗(yàn)得以往下推進(jìn)，以終獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

此時(shí)，實(shí)驗(yàn)者可選用對(duì)支原體*的抑制劑，通過(guò)對(duì)細(xì)胞的前期處理，中期加藥，逐步通過(guò)4代左右的培養(yǎng)，得以將支原體污染*清除，確保試驗(yàn)順利推進(jìn)，結(jié)果準(zhǔn)確。

*此類試劑眾多，筆者周圍的實(shí)驗(yàn)人做過(guò)很多嘗試，其中效果確切且性價(jià)比較高的當(dāng)屬德國(guó)Minerva公司的ZellShield®祛除劑。

它的原理是：通過(guò)抑制支原體增殖中某種蛋白的合成，達(dá)到抑制新的支原體增殖的目的。屬?gòu)?fù)合型的新型抗生素。

注：使用ZellShield®時(shí)，不需使用鏈青霉素。

 

操作步驟：

一步：研究發(fā)現(xiàn)，98%的支原體污染發(fā)生在細(xì)胞間隙。因此，首先要把細(xì)胞消化下來(lái)，放入離心管，懸浮沖洗，離心，棄上清，反復(fù)三次。此時(shí)可將細(xì)胞上大部分的支原體去除，為進(jìn)一步加藥抑制做好準(zhǔn)備。

第二步：培養(yǎng)液中加入1%的ZellShield®，細(xì)胞進(jìn)行正常培養(yǎng)。新的支原體增殖受到抑制，舊的支原體隨著細(xì)胞的換液逐步減少，通過(guò)4代左右的培養(yǎng)，細(xì)胞中的支原體基本可被*清除。

此試劑價(jià)格約2800元/50ml，1%濃度使用，可保證大量細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)得以順利推進(jìn)。性價(jià)比較高，但祛除過(guò)程時(shí)間稍長(zhǎng)。

有些細(xì)胞保種中心，當(dāng)珍貴細(xì)胞被支原體污染后，會(huì)將Mynox®和ZellShield®結(jié)合使用，效果確切，結(jié)果令人滿意。

工作環(huán)境中支原體污染，解決方案

如果實(shí)驗(yàn)室的細(xì)胞經(jīng)常發(fā)生支原體污染，則需考慮的污染源可能來(lái)以下幾個(gè)方面：

1、細(xì)胞種子被污染，解決方法參見(jiàn)以上“方法二”和“方法三”；

2、細(xì)胞培養(yǎng)中，使用未經(jīng)嚴(yán)格過(guò)濾祛除支原體的牛血清。

某些血清生產(chǎn)廠，為低價(jià)占領(lǐng)市場(chǎng)同時(shí)還能獲得充足利潤(rùn)，他們需要降低生產(chǎn)成本，所以會(huì)將生產(chǎn)中，成本高的100nm過(guò)濾三次的步驟縮減，導(dǎo)致血清成為支原體的污染源。

(標(biāo)準(zhǔn)的血清生產(chǎn)規(guī)范為：粗血清需經(jīng)七次過(guò)濾，后三次為100nm加壓過(guò)濾，可以清除支原體)；

此情況需詳細(xì)考察血清供貨商的專業(yè)程度，通過(guò)索要《檢測(cè)報(bào)告》等書面文件為血清獲得更多質(zhì)量保證。同時(shí)，對(duì)專業(yè)水平不高的血清供貨商，適當(dāng)延長(zhǎng)血清試用期。

3、潔凈臺(tái)、細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)部、培養(yǎng)箱水槽、液氮罐，培養(yǎng)間內(nèi)部的水浴鍋等環(huán)境被支原體污染，可對(duì)工作區(qū)域進(jìn)行消毒。有以下三種方法：

A、甲醛高錳酸鉀熏蒸消毒

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• 40%甲醛溶液用量為10ml/m3，高錳酸鉀用量為5g/m3
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• 先將稱好的高錳酸鉀放到開(kāi)放性容器內(nèi)，然后倒入甲醛溶液
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• 人員迅速撤離，密閉消毒空間
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• 熏蒸消毒要求密閉消毒24h以上

缺點(diǎn)：甲醛有刺激氣味，細(xì)胞間1-2周無(wú)法使用。

B、酒精擦拭

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• 用75%的酒精對(duì)超凈臺(tái)、培養(yǎng)箱、桌面等進(jìn)行擦拭
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• 再通風(fēng)10分鐘
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• 紫外照射30分鐘

缺點(diǎn)：操作較為繁瑣，酒精容易揮發(fā)，消毒維持時(shí)間不長(zhǎng)。

C、用專門清除支原體的噴霧劑或濕巾消毒

目前，被各大實(shí)驗(yàn)室普遍使用的是Mycoplasma-offTM噴霧劑和濕紙巾。它添加了可主動(dòng)殺除支原體的Mynox®試劑，可在 幾分鐘內(nèi)將支原體確切殺除，無(wú)殘留，無(wú)腐蝕性，無(wú)致癌性。

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• 均勻噴于待消毒的潔凈臺(tái)或?qū)嶒?yàn)設(shè)備表面
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• 等待5-10分鐘
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• 用干燥紙巾將噴過(guò)的表面擦拭干凈
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• 通風(fēng)2-3分鐘

對(duì)于移液器，門把手，電話等器材，可使用支原體清除濕巾。擦拭后，應(yīng)讓其被消毒物體的表面保持濕潤(rùn)，再讓其自然風(fēng)干。

D、培養(yǎng)箱水槽、培養(yǎng)間內(nèi)部的水浴鍋

水槽經(jīng)常會(huì)成為支原體以及真菌霉菌滋生的污染源。

解決方法：

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• 勤于清洗顯得尤為重要。
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• 上普遍使用一種水源保護(hù)劑0.5%WaterShieldTM，加入水中，預(yù)防水源被支原體、真菌、霉菌污染。此試劑不易揮發(fā)。一個(gè)月有效。

水槽只需定期添水即可。

優(yōu)點(diǎn)：操作方便，價(jià)格便宜。

總之，細(xì)胞培養(yǎng)中，支原體污染發(fā)生頻繁。有時(shí)帶來(lái)的危害會(huì)造成實(shí)驗(yàn)的巨大損失。應(yīng)經(jīng)常檢測(cè)和及時(shí)排除支原體污染，讓細(xì)胞在健康安全的環(huán)境下生長(zhǎng)，為獲得準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，打下良好的基礎(chǔ)。