細胞培養過程中,由于實驗環境、操作者鼻腔口腔、實驗器材等很多地方都有支原體的存在。因此,細胞發生支原體污染的頻率很高。據美國數據統計,細胞發生支原體污染的幾率在70%以上。
同時,由于支原體直徑很小,僅在180nm~350nm之間,只有通過電鏡才能看到。因此,支原體污染不易被實驗者肉眼發覺。而支原體污染是個循序的過程,普通抗生素對其無效。因此,被支原體污染的細胞會持續受到影響,導致實驗數據不準確。
支原體污染不僅是細胞培養中需要克服的現象,而且是制藥、生物制品生產中需要加以避免的。支原體污染的影響是什么?
●抑制細胞增殖達50%
●影響免疫反應
●影響病毒增殖和感染率
●引起染色體畸變和易位
●干擾雜交瘤技術使被污染細胞在HAT培養基更敏感
●在細胞壁上附著支原體會改變細胞壁完整性。
●降低電穿孔轉染率達5%
總之,支原體污染影響細胞所有的代謝功能。
細胞被支原體污染,解決方案
方法一:確認細胞已被支原體污染,終止試驗,丟棄所有被污染的細胞和耗材。
重新復蘇細胞,注意選用未被污染的細胞株、血清和培養基,并規范操作。
方法二:對于珍貴的,樣品不可再得的細胞,或價格昂貴的種子細胞,不但無法丟棄,而且作為種子細胞,還需要*祛除支原體污染。
此時,需選用特異性的支原體殺除劑,清除污染,保護細胞。
目有效的方法是是德國的一款專li生物試劑,由Minerva公司生產,品名Mynox®。
此試劑可在2-3小時內將支原體主動殺除,但對細胞無毒害作用。特別適合細胞保種。
Mynox®為枯草桿菌中提取出的生物制劑,加入培養液中,可特異性地與支原體膜結合,改變膜通透性。通過此生物物理的方法,2~3小時內,即可把細胞中的支原體殺除掉。因為細胞膜結構與支原體膜不同,故Mynox®不會與細胞膜結合,因此無細胞毒性。
注意:3小時后,需將此試劑洗脫,將細胞更換到新的培養耗材和培養液中,重新培養。
此時,不應使用PCR方法檢測細胞中支原體。由于支原體解體,故PCR結果為假性強陽性。
具體操作流程見下圖:
Mynox®祛除貼壁細胞中支原體的流程圖
Mynox®殺除支原體功能強大有效,但由于價格昂貴,上圖中使用的200ul人民幣要5000元左右,使得應用于細胞保種的數量受到價格的限制。
方法三:對于已耗費很多時間,大量擴增起來的細胞,或經過基因轉染、體外刺激等大量工作處理過的細胞,如果發現細胞被支原體污染了,怎么辦?此時由于前期工作量巨大,使操作人員無法丟棄已有細胞。
但由于價格原因,又無法使用方法二提到的昂貴試劑殺除細胞上的支原體,
同時,實驗人員還需要清除細胞上的支原體污染,讓實驗得以往下推進,以最終獲得準確的實驗數據。
此時,實驗者可選用對支原體特xiao的抑制劑,通過對細胞的前期處理,中期加藥,逐步通過4代左右的培養,得以將支原體污染*清除,確保試驗順利推進,結果準確。
世界此類試劑眾多,筆者周圍的實驗人做過很多嘗試,其中效果最確切且性價比較高的當屬德國Minerva公司的ZellShield®祛除劑。
它的原理是:通過抑制支原體增殖中某種蛋白的合成,達到抑制新的支原體增殖的目的。屬復合型的新型抗生素。
注:使用ZellShield®時,不需使用鏈青霉素。
操作步驟:
第一步:研究發現,98%的支原體污染發生在細胞間隙。因此,首先要把細胞消化下來,放入離心管,懸浮沖洗,離心,棄上清,反復三次。此時可將細胞上大部分的支原體去除,為進一步加藥抑制做好準備。
第二步:培養液中加入1%的ZellShield®,細胞進行正常培養。新的支原體增殖受到抑制,舊的支原體隨著細胞的換液逐步減少,通過4代左右的培養,細胞中的支原體基本可被*清除。
此試劑價格約2800元/50ml,1%濃度使用,可保證大量細胞的實驗得以順利推進。性價比較高,但祛除過程時間稍長。
有些細胞保種中心,當珍貴細胞被支原體污染后,會將Mynox®和ZellShield®結合使用,效果確切,結果令人滿意。
工作環境中支原體污染,解決方案
如果實驗室的細胞經常發生支原體污染,則需考慮的污染源可能來以下幾個方面:
1、細胞種子被污染,解決方法參見以上“方法二"和“方法三";
2、細胞培養中,使用未經嚴格過濾祛除支原體的牛血清。
某些血清生產廠,為低價占領市場同時還能獲得充足利潤,他們需要降低生產成本,所以會將生產中,成本最高的100nm過濾三次的步驟縮減,導致血清成為支原體的污染源。
(全球標準的血清生產規范為:粗血清需經七次過濾,最后三次為100nm加壓過濾,可以清除支原體);
此情況需詳細考察血清供貨商的專業程度,通過索要《檢測報告》等書面文件為血清獲得更多質量保證。同時,對專業水平不高的血清供貨商,適當延長血清試用期。
3、潔凈臺、細胞培養箱內部、培養箱水槽、液氮罐,培養間內部的水浴鍋等環境被支原體污染,可對工作區域進行消毒。有以下三種方法:
A、甲醛高錳酸鉀熏蒸消毒
40%甲醛溶液用量為10ml/m3,高錳酸鉀用量為5g/m3
先將稱好的高錳酸鉀放到開放性容器內,然后倒入甲醛溶液
人員迅速撤離,密閉消毒空間
熏蒸消毒要求密閉消毒24h以上
缺點:甲醛有刺激氣味,細胞間1-2周無法使用。
B、酒精擦拭
用75%的酒精對超凈臺、培養箱、桌面等進行擦拭
再通風10分鐘
紫外照射30分鐘
缺點:操作較為繁瑣,酒精容易揮發,消毒維持時間不長。
C、用專門清除支原體的噴霧劑或濕巾消毒
目前,被各大實驗室普遍使用的是Mycoplasma-offTM噴霧劑和濕紙巾。它添加了可主動殺除支原體的Mynox®試劑,可在 幾分鐘內將支原體確切殺除,無殘留,無腐蝕性,無致癌性。
均勻噴于待消毒的潔凈臺或實驗設備表面
等待5-10分鐘
用干燥紙巾將噴過的表面擦拭干凈
通風2-3分鐘
對于移液器,門把手,電話等器材,可使用支原體清除濕巾。擦拭后,應讓其被消毒物體的表面保持濕潤,再讓其自然風干。
D、培養箱水槽、培養間內部的水浴鍋
水槽經常會成為支原體以及真菌霉菌滋生的污染源。
解決方法:
勤于清洗顯得尤為重要。
國際上普遍使用一種水源保護劑0.5%WaterShieldTM,加入水中,預防水源被支原體、真菌、霉菌污染。此試劑不易揮發。一個月有效。
水槽只需定期添水即可。
優點:操作方便,價格便宜。
總之,細胞培養中,支原體污染發生頻繁。有時帶來的危害會造成實驗的巨大損失。應經常檢測和及時排除支原體污染,讓細胞在健康安全的環境下生長,為獲得準確的實驗結果,打下良好的基礎